HIV resistenstest

Bakgrund

HIV kan utveckla resistens vid suboptimal behandling, dvs om behandlingen ges med ett eller två läkemedel (vilket var vanligt före 1996) eller om patienten inte följer behandlingsordinationen (bristande följsamhet). Hur lätt detta sker beror på ett antal faktorer, ff.a vilka läkemedel som används. Resistent virus som utvecklas hos en behandlad patient kan även smitta till nya patienter. Både förvärvad och överförd resistens kan leda behandlingssvikt. Av detta skäl används resistenstest som ett stöd för behandlingsval vid diagnos och vid behandlingssvikt. Det finns en omfattande dokumentation som anger att resistenstest på dessa indikationer är av klinisk nytta och är kostnadseffektivt.


Rutinmässig HIV resistenstest utförs med genotypisk metod där mutationer i HIVs arvsmassa som medför sänkt känslighet för HIV läkemedel (s.k. resistensmutationer) identifieras via DNA sekvensering. Det finns även metoder för fenotypisk resistenstest (se nedan), men dessa används inte svensk rutinvård eftersom de är kostsamma och långsamma.

Genotypisk resistensbestämning identifierar mutationer i proteas (PR) och omvänt transkriptas (RT). Integrasgenen vid behandling med integrashämmare och höljegenen vid behandling med inträdeshämmare kan undersökas vid behov. Resultatet utvärderas via närvaro eller frånvaro av specifika resistensmutationer i dessa gener. För CCR5-hämmare utvärderas inte enstaka mutationer utan hela sekvensen för V3-området i höljegenen.

Metodik

Det finns både kommersiella och in-house metoder för rutinmässig genotypisk HIV resistenstest. I bägge fallen är utgångsmaterialet vanligtvis HIV-1 RNA från viruspartiklar i patientplasma, men HIV-1 DNA från mononukleära celler i blod kan användas i speciella situationer. RNA renas fram ur plasma och målområdet amplifieras via RT-PCR. PCR amplikonen sekvenseras med Sanger-metodik. Den erhållna nukleotidsekvensen analyseras enligt nedan.

Provtagning

Provmaterialet utgörs av EDTA-helblod ur vilket plasma erhålls. Hos behandlade patienter med HIV-associerad neurokognitiv svikt kan resistensanalysen utföras på virus från cerebrospinalvätska (CSF). Det är viktigt att ta prov under pågående behandling eller så snart som möjligt efter utsatt behandling eftersom resistensmutationer snabbt (veckor) kan försvinna ur den dominerande plasma­viruspopulationen, så kallad reversion, om behandlingen sätts ut eller ändras. Reversion kan även förekomma efter smitta med resistent HIV eftersom den som smittas i allmänhet inte har behandling.

Plasmaprov med < 500–1000 HIV RNA kopior/ml kan vara svåra att analysera med rutinmetoder. Känsligheten kan ökas genom modifiering av metoden. Om sådan analys önskas ska det framgå av remissen. I dessa all kan även analys av HIV DNA i celler vara ett alternativ.

Resistenstest kan utföras på sparade frysta prover och det kan ibland även vara motiverat att återanalysera gamla resistensresultat med uppdaterade tolkningsalgoritmer, framför allt inför behandling med nytillkomna läkemedel inom etablerade grupper.

Tolkning och klinisk användning

Den erhållna nukleotidsekvensen undersöks för närvaro av kända resistensmutationer. Det finns flera web-platser och kon­sensus­dokument från expertgrupper i Europa och USA som ger vägledning för tolkning av testresulta­ten, bl.a. Stanford (hivdb.stanford.edu), ANRS (www.medpocket.com) och Euresist (engine.euresist.org). Dessa verktyg identifierar resistensmutationer och använder sedan olika typer av bioinformatiska metoder för att bedöma vilka läkemedel (Stanford och ANRS) eller läkemedelskombinationer (Euresist) som kan förväntas ha bra respektive sämre klinisk effekt.

Laboratoriet bör ge en skriftlig tolkning av mutationsmönstret samt möjlighet att diskutera svaret eftersom detta har visats förbättra behandlingsresultatet. Om resistens föreligger så bör resultaten utvärderas vid behandlingskonferens med erfarna kliniker och helst även klinisk virolog.

Test för HIV coreceptor-användning (tropism-test)

Inför användning av CCR5-hämmare (maraviroc) så rekommenderas att coreceptoranvändningen (celltropismen) för patientens virus undersöks.

Bakgrunden till CCR5-hämmarna är att HIV vid infektion av nya celler måste binda till en s.k. co-receptor, förutom den primära receptorn CD4. De viktigaste co-receptorerna är CCR5 och CXCR4. HIV-1 varianter som kan använda CXCR4 (X4 virus) är associerade med ett snabbare förlopp av immundefekten än varianter som bara kan använda CCR5 (R5 virus). Nomenklaturen på området har ändrats genom åren och är något snårig, men CXCR4-positivitet är i princip synonymt med rapid/high, syncytium-inducing (SI), MT-2 positivt och T-cell tropic (T-tropic), medan CCR5-positivitet är synonymt med slow/low, non-syncytium-inducing (NSI), MT-2 negativitet och monocyt tropic (M-tropic). Inte sällan förekommer R5 virus och X4 virus samtidigt hos en patient (R5X4 virus, dual-mixed phenotype [DM]).

I Sverige och större delen av Europa rekommenderas i första hand genotypisk tropismtest. Vid denna sekvensbestäms V3 området i HIV:s höljegen (env). Sekvensen analyseras därefter med ett bioinformatisk program. I första hand rekommenderas Geno2Pheno (www.geno2pheno.org) som ger en bedömning av om patientens viruspopulation använder CCR5 co-receptorn, CXCR4 co-receptorn eller båda. En viss osäkerhet i bedömningen kan finnas och detta uttrycks som "false positive rate", se europeiska guidelines från 2011 (Vandekerckhove, Lancet Infect Dis 2011;11:394). Metoden är ff.a utvecklad för subtyp B och precisionen för vissa andra subtyper kan vara sämre. Om hela eller delar av viruspopulationen använder CXCR4 co-receptorn bör inte CCR5-hämmare användas. Om byte till CCR5-hämmare övervägs hos patienter med låga eller icke-detekterbara virusnivåer kan man analysera ett prov med högre virusnivåer taget innan den senaste behandlingen. Alternativt kan test på DNA från perifera mononukleära celler övervägas.

Fenotypisk tropismtest, t.ex. Trofile-testen från Monogram, San Francisco, USA) finns tillgängligt vid kommersiella internationella laboratorier, men rekommenderas inte för rutinbruk i Sverige. Coreceptor-användning kan testas genom odling av virus på cell-linjer såsom MT-2, U87 och GHOST men dessa metoder används inte i klinisk praxis.

HIV-2

De resistenstester som finns tillgängliga i Sverige fungerar bara på HIV-1. Det finns laboratorier i Europa (fr.a. i Portugal och Frankrike) som utför genotypisk HIV-2 resistenstest till vilka prover kan förmedlas. Tolkningen av testen är dock mer osäker för HIV-2 än för HIV-1 eftersom kunskapen om vilka resistensmutationer som förekommer och deras kliniska betydelse är inkomplett.

Minoritetsviruspopulationer

Begreppet minoritetsviruspopulationer används för att känneteckna att det kan finnas resistens i patientens viruspopulation som inte detekteras i rutindiagnostiken om patienten har en mix av känsligt och resistent virus i blodet. Vid rutintestning ligger detektionsgränsen för resistens på cirka 20% (dvs resistens upptäcks om minst 20% av viruspartiklarna i blodet bär på resistensmutationen i fråga). Nya data visar att närvaro av resistens i minoritetsviruspopulationer kan ledda till sämre kliniskt utfall vid HIV behandling. Metoder, fr.a. next-generation sequencing (NGS), som kan upptäcka resistens hos mindre virusvarianter kan komma att introduceras i kliniken under de kommande åren.

Fenotypiska HIV-resistenstester

Fenotypiska resistenstester innebär att man biologiskt mäter hur känsligt en patients HIV-stam är för antiretrovirala läkemedel. Det virus som testas kan vara antingen en HIV-stam som har isolerats från patienten blod eller ett så kallat rekombinantvirus (se nedan). Fenotypiska resistenstester har fått begränsad klinisk användning eftersom de är dyra och tidsödande. I Sverige används dessa metoder inte i klinisk praxis utan rutinmässig HIV-resistenstestning utförs med genotypisk metodik. Detta innebär också att mycket av den kliniska erfarenheten och vetenskapliga dokumentationen är baserad på resultat från genotypiska resistenstester.

Fenotypiska resistenstester har använts i forsknings- och utvecklingssyfte sedan det första antiretrovirala preparatet registrerades (AZT, 1986). De traditionella fenotypiska HIV-resistenstesterna utfördes via odling av HIV-isolat i perifera blodlymfocyter (PBMC) från blodgivare. De PBMC-baserade testerna har utgått eftersom de var arbetskrävande, tidsödande, dyra och inexakta. Detta beror bl.a. på att de involverar en initial virusisolering, kvantifiering av uppodlat virus och ett avslutande dos-responsförsök med isolerat virus i närvaro av en spädningsserie av den/de aktuella antivirala läkemedlen. Förutom den betydande tidsåtgången (ca 8-10 veckor) och den höga kostnaden så är resultatet (IC50-värde, 50% inhibitory concentration) höggradigt variabelt p.g.a. av olikheter i virulensegenskaper hos patientvirus och kvalitén på de använda målcellerna (PBMC från blodgivare).

Under senare delen av 1990-talet introducerades en ny generation av fenotypiska resistenstester (Virco, Antivirogram; Mechelen, Belgien samt ViroLogic/Monogram, PhenoSense HIV; San Francisco, USA) som ger säkrare och mer reproducerbara resultat. Dessa tester baseras på rekombinantvirus-teknik där arvsmassan för den aktuella genen hos patientens HIV-stam PCR-amplifieras ur plasma. Arvmassan, som alltså motsvarar PR och RT eller integras för patientens HIV, sätts in (rekombineras) i en pol- eller integras-deleterad HIV-1 vektor. Det rekombinanta viruset får replikera in vitro i mottagliga målceller i närvaro av respektive antivirala preparat. Testerna är automatiserade och har hög kapacitet. Resultaten från dessa tester anges vanligtvis i "fold-resistance" d.v.s. hur många gånger mer läkemedel som behövs för att hämma patientens virus jämfört med fullt känsliga referensvirus. Varje HIV läkemedel har sin egen "cut-off" för resistens. Rekombinantvirustester har fått begränsad klinisk användning och har aldrig använts i Sverige eftersom de är jämförelsevis långsamma (fn 2-8 veckor), dyra och att de enbart erbjuds att ett par kommersiella företag. Testerna har dock en plats i forskningsstudier under utvecklingsfasen för nya antiretrovirala läkemedel då den genotypiska mutationsprofilen ofta är helt eller delvis okänd. Det skall också understrykas att resultaten från fenotypiska tester ligger som grund för värderingen och betydelsen av genotypiskt påvisade mutationer.

På sls.se använder vi cookies för att din upplevelse ska bli så bra som möjligt. Genom att fortsätta använda vår webbplats accepterar du att cookies används.