Resistenstest herpesvirus (HSV, VZV, CMV, HHV-6)

Bakgrund

Läkemedel mot herpesgruppens virus var bland de första antivirala läkemedel som registrerades. Medel mot herpes simplex (HSV) används i stor omfattning för behandling av genitala herpesblåsor, men även mot oral infektion. Långtidsprofylax till individer med frekventa recidiv är vanlig. Behandling är nödvändig vid herpesencefalit, och sätts ofta in vid minsta misstanke på sådan sjukdom. Antiviral behandling av varicellavirus (VZV) rekommenderas vid vattkoppor hos immunsupprimerade, efter puberteten, i neonatalperioden och vid svår sjukdom. Bältros hos äldre, immunsupprimerade och vid speciella lokalisationer bör också behandlas. Behandlingsindikation för cytomegalovirus (CMV) är sjukdom hos immunsupprimerade och bör övervägas vid kongenital CMV infektion med CNS-symtom. Profylaktisk behandling avseende CMV av immunsupprimerade patienter förekommer också och är framgångsrik. Få studier finns för humant herpesvirus-6 och 7 (HHV-6 och HHV-7) men de kan behandlas liknande CMV. Indikation har varit sjukdom hos immunsupprimerade eller encefalit. Mononukleos orsakad av Epstein-Barr virus (EBV) kan vara en allvarlig sjukdom. Antiviral behandling hämmar virusreplikationen, men har ingen påvisad effekt på symptomen. Man har inte heller påvisat effekt av antiviral behandling på EBV-orsakade tumörer och lymfoproliferativ sjukdom som uppkommer i samband med immunsuppression, Humant herpesvirus-8 (HHV-8) är kopplad till Kaposis sarkom, Castlemans sjukdom och primärt effusionslymfom. Effekt av antiviral terapi har beskrivits, men systematiska studier saknas.

Resistensutveckling

Resistens mot de antivirala medlen kan uppstå vid långtidsbehandling (främst immunsupprimerade och AIDS patienter), suboptimal behandling (profylax, dålig följsamhet på grund av biverkningar eller slarv, samt dålig biotillgängligheten) samt vid behandling av patienter med höga virusmängder (kongenitalt smittade, kraftigt och/eller långvarigt immunsupprimerade patienter). Av de idag tillgängliga medlen för behandling av herpesvirus behöver tre (aciklovir, penciklovir, ganciklovir samt deras prodroger valaciklovir, famciklovir och valganciklovir) monofosforyleras av viralt kinas för att omvandlas till aktiv substans. Den vanligaste formen av resistens mot ovanstående nukleosidanaloger förorsakas av mutationer i de virala kinaserna (CMV-pUL97, HHV6–U69, HSV och VZV-tymidinkinas). Dessa proteiner är inte essentiella för virusreplikationen och virus med muterat kinas kan selekteras vid antiviral behandling. Normalt är 0,01 - 0,7 % av HSV populationen hos obehandlade resistenta mot nukleosidanaloger på grund av förändrat kinas. Utsöndring av resistenta HSV stammar ses hos 0,1-0,4 % av patienterna vid korttidsbehandling, 8 – 12 % av patienterna vid långtidsbehandling och 27 – 43 % av patienterna i studier av allogent benmärgstransplanterade patienter . Även muterat CMV-pUL97 finns i låg mängd hos obehandlad viruspopulation. Frekvensen resistenta CMV stammar på grund av förändrat pUL97 ökar med behandlingstiden (8 % efter 3 månaders ganciklovir behandling och 64 % efter 15 månaders behandling). Resistenta VZV stammar kan uppstå efter långtidsbehandling med nukleosidanaloger. De virusstammar som har förändrat kinas är oftast korsresistenta mot de andra nukleosidanalogerna.

Resistens kan även uppkomma genom mutationer i de virala DNA polymeraserna. Det är svårare att inducera mutationer i DNA polymeraset jämfört med kinasen och längre behandlingstid krävs. Resistens mot foskarnet (licenspreparat) och cidofovir (ej tillgänglig i Europa) kan endast uppstå genom mutation i DNA polymeraset. Mutationer i CMV DNA polymeras som orsakar ganciklovir-resistens ger korsresistens mot cidofovir. Korsresistens mellan foskarnet och nukleotid/nuklesidanaloger är mindre vanligt.

Resistensbestämning är viktigt att göra när immunsupprimerade patienter inte svarar som förväntat på den antivirala behandlingen eller om symptom återkommer under pågående behandling

.

Principer för testning av virus känslighet för antiviral medel

Nedsatt effekt av antiviral behandling kan orsakas av antiviral resistens samt behandlingssvikt av annat skäl. Svikt kan uppstå vid suboptimal behandling av virusinfektion lokaliserad i platser med dålig biotillgänglighet för drogen t.ex. öga och CNS, vid behandling av patienter med dålig immunstatus samt vid behandling av patient med hög virusmängd. Antiviral resistens orsakas av genetiska förändringar i virusarvsmassan.

Känsligheten för antivirala medel kan bestämmas med fenotypiska och genotypiska metoder. Vid fenotypisk analys odlas virus i närvaro av antivirala medel. Den koncentration av antiviralt medel som reducerar den virala tillväxten med hälften beräknas. Vid genotypisk analys studeras specifika mutationer i den virala arvsmassan som har identifierats att orsaka resistens. Oavsett vilken metod som används för känslighetsbestämningen bör en tolkning medfölja analyssvaret där den kliniska användbarheten för registrerade läkemedel anges.

I Sverige utförs genotypisk analys för HSV och CMV vid Folkhälsomyndigheten och fenotypisk analys för HSV samt genotypisk analys av CMV vid Göteborgs mikrobiologiska laboratorium. Vid frågeställning om resistens för VZV och HHV-6 kontakta Folkhälsomyndigheten som kan hänvisa till utländska laboratorier för analys.

Provmaterial

Vid resistensfrågeställning bör man försöka ta prov från det organ som drabbats, t ex blåsmaterial vid hudutslag, likvor vid CNS symptom, glaskroppsvätska vid retinit och blodprov vid systemisk infektion. Detta eftersom en patient kan ha olika virusstammar i olika organ.

Fenotypiska tester

Virus som isolerats i cellkultur blandas med antiviralt medel i olika koncentrationer. Den koncentration som ger 50% reduktion av virus tillväxt (inhibitory concentration 50; IC50) räknas ut. Hämningen av virustillväxt kan utvärderas genom:

a. Plackreduktion (Bedömning av minskningen av antalet härdar (plack) av virusförändrade celler med granskning i ljusmikroskop
b. Reduktion av antigenuttryck, utvärderat genom immunfluorescens på celler eller med ELISA-teknik
c. Reduktion av produktion av infektiöst virus genom virustitrering av supernatant eller kvantitativ genomanalys.

För fenotypiska tester krävs att virus först isoleras och propageras till den mängd som behövs för analysen. En förutsättning för att testerna ska kunna bedömas adekvat är att en standardiserad virusmängd analyseras. Ofta fås relativt stor variation av IC50 när ett och samma virus undersöks vid olika laboratorier. Olika metoder är oftast förklaringen, men variation i virusmängd samt cellernas känslighet för infektion kan ge divergerande resultat även om identiska metoder används. Även om IC50 kan fastställas måste värdet korreleras till koncentrationen av virus och av läkemedel i den infekterade vävnaden.

Fördelar med fenotypiska tester är all resistens/nedsatt känslighet kan påvisas, även sådan som orsakas av hittills oidentifierade mutationer. Resultaten kan därmed också vara lättare att tolka än resultaten av genotypiska tester.

Nackdelar är att testerna kräver isolering av viabelt virus, kan ta lång tid och är svårare att standardisera. Om en patient har flera varianter av samma virus kan det ske en selektion emot resistens i den primära virusisoleringen och för resistent virus i själva resistenstesten. Fenotypiska tester är oftast dyrare än genotypiska tester.

HSV växer snabbt och den fenotypiska känslighetsbestämningen kan ge fullständig känslighetsprofil för olika antiviraler. CMV växer långsamt och genotypisk analys är att föredra.

Genotypiska tester.

Mutationer i virus arvsmassa som orsakar resistens har identifierats genom jämförelse av DNA sekvenser från känsligt och resistent virus och in vitro mutagenes.

Vid misstanke om resistens kan det vara enklare att sekvensbestämma virusets arvsmassa än att utföra en fenotypisk test. Man kan sekvensera de genomområden där man vet att förändringar som medför resistens finns. De gener som är aktuella är i första hand tymidinkinasgenen för HSV och pUL97 för CMV. Det finns även mutationer påvisade i polymerasgenen för både HSV och CMV. De genotypiska testerna görs oftast direkt på patientmaterialet men kan även utföras på isolerat virus.

Fördelar med de genotypiska testerna är att även icke viabelt virus kan analyseras. Ofta kan originalmaterial från patienten användas, och genom detta undviks selektion av en vissa virusstammar under uppodling och resistenstestning. Undersökningarna går relativt fort att utföra, speciellt om man kan inrikta sig på ett begränsat antal mutationer, och kan då också bli förhållandevis billiga.

Nackdelar är att man inte säkert har identifierat alla resistensgivande mutationer, och att det ibland kan vara svårt att fastställa hur enskilda mutationer och kombinationer av mutationer påverkar känsligheten.

För CMV kan en genotypisk test vara att föredra då CMV växer långsamt. Vid frågeställning om ganciclovirresistens bör genotypiskt test användas först. Cirka 98 % av ganciklovirresistenta stammar har muterat pUL97 som kan påvisas med en genotypisk test. Om patienten har behandlats med olika antiviraler och korsresistens kan ha uppkommit måste både pUL97 och DNA polymeras analyseras.

Mutationer som inducerar resistens

HSV: Nära 100% av aciclovir/penciklovir-resistenta HSV stammar har förändrat tymidinkinas. Mutationerna i TK delas in i tre grupper, TK-negativ (TKN), TK-partiell (TKP) och TK-förändrad (TKF). En TKN-stam saknar all typ av TK-aktivitet, en TKP-stam har reducerad aktivitet medan en TKF-stam fosforylerar det naturliga substratet (tymidin) men inte aciklovir eller penciklovir. Mer än 95 % av de aciklovir- och penciklovirresistenta stammarna är TKN eller TKP. Merparten av TKN är orsakade av en nukleotidinsertion eller deletion i TK-genen, detta förorsakar en läsramsförändring vilket ofta leder till ett förkortat TK-protein. HSV har två GC-rika regioner där merparten av mutationerna sker, så kallade ”hot-spots”. Merparten av HSV-stammarna som har förändrat TK är korsresistenta för aciklovir och penciklovir. Resistens kan även uppkomma genom mutationer i de virala DNA-polymeraset. Flera av dessa mutationer orsakar korsresistens mot aciklovir och foskarnet. Det är dock ovanligt med korsresistens för aciklovir och penciklovir orsakade av mutationer i DNA-polymerasgenen. Endast enstaka mutationer som orsakar korsresistens för alla antivirala medel har rapporterats.

 

CMV: Merparten (98%) av ganciklovir-resistensta CMV isolat har förändrat kinas (pUL97). Mutationer i 16 olika aminosyror (460, 520, 591-603, och 607) har visats orsaka ganciklovir-resistens. Mutationer i 5 aminosyror är särskilt vanliga.

Mutationer i CMV DNA polymeras kan orsaka resistens för ganciklovir, cidofovir och foskarnet. Merparten av de mutationer som orsakar ganciklovirresistens är korsresistenta mot cidofovir.

VZV: Ett 60-tal aciklovirresistenta VZV stammar har beskrivits i litteraturen. Man har endast påvisat resistent VZV hos immunosupprimerade patienter. Merparten av dem har förändrat tymidinkinas. Cirka 50-70% av de resistenta stammarna hade trunkerat tymidinkinas. Mutationer i VZV DNA polymeraset som orsakar aciklovir eller foskarnet-resistens har påvisats för ett fåtal isolat.

HHV-6: I in vitro försök har en mutation i HHV-6 kinas motsvarande position 460 för CMV-pUL97 inducerats med hjälp av ganciklovir. En mutation som orsaka cidofovir och ganciklovirresistens har påvisats i HHV-6 DNA polymeraset.

Text: Mia Brytting 2016-01-22

På sls.se använder vi cookies för att din upplevelse ska bli så bra som möjligt. Genom att fortsätta använda vår webbplats accepterar du att cookies används.