Resistenstest

Inledning

Antiviral behandling av kronisk hepatit B med nukleosid/nukleotidanaloger har ökat kraftigt i världen och – i mindre skala – i Sverige. Som en följd av det har resistensutveckling blivit ett problem, och påvisande av resistensmutationer har blivit ett behov i klinisk diagnostik. Här beskrivs kort de vanligaste resistensmutationerna och metoder för att detektera dem.

Bakgrund

Kronisk hepatit B har ofta ett okomplicerat naturalförlopp som inte kräver behandling. I fall med utdragen inflammation – och särskilt om leverfibros påvisas – är behandling motiverad för att förhindra utveckling av cirros eller levercancer. Behandlingen ges antingen i form av pegylerat interferon subkutant en gång per vecka under 6-12 månader eller oral antiviral behandling dagligen under flera års tid. Interferonbehandling har en både antiviral och immunmodulatorisk effekt och ger oftare en varaktig effekt, men nackdelen är högre kostnad och mer biverkningar.

De antivirala medel som hittills använts interagerar med polymeraset och verkar främst på den reversa transkriptionen. Den aktiva fickan i reversa transkriptaset (RT) uppvisar stora likheter men RT i HIV med bland annat ett identiskt YMDD (tyr-met-asp-asp)-motiv. Flera antiretrovirala preparat har också visat sig ha god effekt även på HBV. Likaledes har mönstren vid resistensmutationer likheter med dem i HIV-RT [1].

Zeffix (3TC, lamivudin; Glaxo) är en nukleosidanalog som 1999 registrerades för HBV-behandling i dosen 100 mg/dag; den fanns tidigare för HIV-behandling under namnet Epivir. Lamivudin har god antiviral effekt med ca 4-5 log medianreduktion av viremin, mycket god tolerans och relativt lågt pris. Nackdelen har visat sig vara hög frekvens återfall efter avslutad behandling och särskilt snabb resistensutveckling (>50% efter 3 års monoterapi) [2]. Ett särskilt problem är att fulminanta skov av hepatit kan utvecklas efter utsättande av behandlingen eller i samband med resistensutveckling.

Adefovir (Hepsera, Gilead) är en nukleotidanalog som 2003 registrerades för HBV-behandling i dosen 10 mg/dag. Det har inte fullt lika god antiviral effekt som lamivudin och kostnaden är betydligt högre. Toleransen är god utan de problem med njurbiverkan som setts vid högre doser. Den stora fördelen är mycket lägre grad av resistensutveckling, vilket tros förklaras av en annorlunda struktur som tillåter inbindning även i närvaro av de mutationer i YMDD-motivet som förtränger den aktiva fickan. Vid lång tids monoterapi utvecklas dock mutationer i andra, näraliggande positioner i en frekvens av 2-5% per år och dessa mutationer har visat sig åtföljas av stigande viremi och klinisk försämring [3, 4].

Flera andra medel har prövats eller är under utprovning, t.ex. emtricabin, tenofovir, entecavir, telbivudin och clevudin. Av dessa finns tenofovir registrerat i Sverige för HIV-behandling under namnet Viread.

Flera studier hav utvärderat kombinationsbehandling, främst avseende antiviral och klinisk effekt, i mindre grad avseende resistensutveckling. Kombination av pegylerat interferon och lamivudin tycks ge större sänkning av viremin och lägre frekvens resistens, men inte högre kvarstående behandlingseffekt [5]. Kombination av lamivudin och adefovir har inte visats förstärka viremireduktionen eller responsfrekvensen, men ger lägre frekvens lamivudinresistens – effekten på adefovirresistensen är oklar. Sammantaget finns en trend mot att övergå till kombinationsbehandling för att undvika resistensutveckling, men samtidigt en tvekan eftersom den kliniska nyttan inte är bevisad.

Resistensmutationer

Vid lamivudinbehandling ses främst mutationer som ger förändring av aminosyra 204 i YMDD-motivet, antingen M204I (YIDD), M204V (YVDD) [2]eller, sällan, M204S (YSDD) [6]. Mutation i kodon 180 (L180M) är också vanlig, särskilt ihop med M204I (vars effekt förstärks). Dessa mutationer ger också resistens mot flera av de andra medlen (se tabell 1), men inte mot adefovir eller tenofovir. Vid adefovirbehandling är mutationsutvecklingne långsammare; det typiska mönstret tycks vara N236T tillsammans med A181V [3]. För flera preparat är resistensmönstren ofullständigt kända klarlagda, så tabellen nedan kommer att behöva uppdateras.

Tabell 1. Relativ betydelse för resistens av ett urval av mutationer i Pol-genen.


V173LL180MA181VT184G/A/I/SS202G/IM204V/I/SQ215SN236TM250V
Lamivudin + ++


+++


Adefovir

+


+ +
Tenofovir

+



+
Emtricabin
++


+++


Entecavir


+ + +

+
Telbivudin




++


Famciclovir
+++


++


Clevudin
++


++


Tidigare numrerades aminosyrorna i RT annorlunda, från kodon 1 i Pol-genen. Numera räknar man i stället från första aminosyran i RT [7]. Detta förklarar varför resistensmutationerna tidigare hade annan betäckning; M552V/I (numera M204V/I) och L528M (numera L180M).

Metoder

Standardmetoden för påvisande av resistens är sekvensering av det segment av polymerasgenen som kodar för den aktiva delen av RT. Detta segment ligger mellan nukleotid 650 och 850 i genomet (aminosyra 180-181: nt 668-673; aminosyra 204: nt 740-742; aminosyra 236: nt 836-838). Nackdelen med sekvensering är att den är arbetsintensiv och därmed dyr, och att det kan vara svårt att identifiera begynnande resistensutveckling. Alternativa metoder för påvisande av resistensmutationer har beskrivits, t.ex. RFLP (restriktionsmönster) [8, 9], realtids-PCR/smältpunktsanalys [8, 10-12], hybridiseringsstrips (Innolipa) [13, 14] och pyrosekvensering [15]. Av dessa har de två förstnämnda nackdelen att de kräver mer specialistkunskap för tolkningen. Innolipa är mer lättanvänt för rutindiagnostik (särskilt för laboratorier som använt Innolipa för HCV-genotypning), men är relativt arbetskrävande och dyrt. Pyrosekvensering är främst lämpat för storskaliga studier.

Det finns inga studier som systematiskt jämfört de olika metoderna, utan i regel har varje metod jämförts med sekvensering och då uppvisat god överensstämmelse. Sensitiviteten för att påvisa en mindre fraktion av en mutantstam tycks vara något högre för RFLP och Innolipa (>10%) än för sekvensering.

Provmaterialet är serum eller plasma. I regel krävs en HBV-DNA-nivå över 1000-5000 kopior/ml för att kunna analysera resistensmutation.

Kostnaden för analysen är beroende av hur många prover som analyseras tillsammans, och blir därför hög om endast enstaka prover körs. I Sverige är efterfrågan på analyser låg och en rimlig prissättning är 1500 kr för Innolipa och 1500-2000 kr för sekvensering.

In vitro-studier av resistens är svåra att göra eftersom HBV i princip inte kan odlas. Effekter av mutationer kan dock undersökas med särskilda transfektionsbaserade system. Sådana studier gör bl.a. av Steven Locarninis grupp i Melbourne och Fabian Zoulims grupp i Lyon [3, 16].

Klinisk användning

Grunden för resistenspåvisning är regelbunden mätning av ALAT och HBV-DNA, förslagsvis 3-4 gånger per år fr.o.m 6 månaders behandling med lamivudin kanske glesare vid adefovirbehandling. Vid stigande HBV-DNA-nivå (>1 log) bör analys avseende resistensmutationer göras. Teoretiskt kan det finnas ett värde i att analysera avseende mutationer redan innan HBV-DNA-nivån stigit, men det rekommenderas inte i nuläget eftersom klinisk nytta inte visats och kostnaden är hög. Upptäckt av resistens och byte eller tillägg av alternativt medel är av särskild vikt vid behandling av patienter med cirros hos vilka resistensutveckling kan åtföljas av leversvikt.

Referenser

  1. Das K, Xiong X, Yang H, et al. Molecular modeling and biochemical characterization reveal the mechanism of hepatitis B virus polymerase resistance to lamivudine (3TC) and emtricitabine (FTC). J Virol 2001;75:4771-9
  2. Tipples GA, Ma MM, Fischer KP, Bain VG, Kneteman NM and Tyrrell DL. Mutation in HBV RNA-dependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo. Hepatology 1996;24:714-7
  3. Angus P, Vaughan R, Xiong S, et al. Resistance to adefovir dipivoxil therapy associated with the selection of a novel mutation in the HBV polymerase. Gastroenterology 2003;125:292-7
  4. Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, et al. Long-term therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B. N Engl J Med 2005;352:2673-81
  5. Janssen HL, van Zonneveld M, Senturk H, et al. Pegylated interferon alfa-2b alone or in combination with lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B: a randomised trial. Lancet 2005;365:123-9
  6. Niesters HG, De Man RA, Pas SD, Fries E and Osterhaus AD. Identification of a new variant in the YMDD motif of the hepatitis B virus polymerase gene selected during lamivudine therapy. J Med Microbiol 2002;51:695-9
  7. Stuyver LJ, Locarnini SA, Lok A, et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology 2001;33:751-7
  8. Allen MI, Gauthier J, DesLauriers M, et al. Two sensitive PCR-based methods for detection of hepatitis B virus variants associated with reduced susceptibility to lamivudine. J Clin Microbiol 1999;37:3338-47
  9. Chayama K, Suzuki Y, Kobayashi M, et al. Emergence and takeover of YMDD motif mutant hepatitis B virus during long-term lamivudine therapy and re-takeover by wild type after cessation of therapy. Hepatology 1998;27:1711-6
  10. Cane PA, Cook P, Ratcliffe D, Mutimer D and Pillay D. Use of real-time PCR and fluorimetry to detect lamivudine resistance- associated mutations in hepatitis B virus. Antimicrob Agents Chemother 1999;43:1600-8
  11. Punia P, Cane P, Teo CG and Saunders N. Quantitation of hepatitis B lamivudine resistant mutants by real-time amplification refractory mutation system PCR. J Hepatol 2004;40:986-92
  12. Whalley SA, Brown D, Teo CG, Dusheiko GM and Saunders NA. Monitoring the emergence of hepatitis B virus polymerase gene variants during lamivudine therapy using the LightCycler. J Clin Microbiol 2001;39:1456-9
  13. Stuyver L, Van Geyt C, De Gendt S, et al. Line probe assay for monitoring drug resistance in hepatitis B virus- infected patients during antiviral therapy. J Clin Microbiol 2000;38:702-7
  14. Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, et al. Monitoring drug resistance in chronic hepatitis B virus (HBV)-infected patients during lamivudine therapy: evaluation of performance of INNO-LiPA HBV DR assay. J Clin Microbiol 2002;40:3729-34
  15. Lindstrom A, Odeberg J and Albert J. Pyrosequencing for detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus. J Clin Microbiol 2004;42:4788-95
  16. Brunelle MN, Jacquard AC, Pichoud C, et al. Susceptibility to antivirals of a human HBV strain with mutations conferring resistance to both lamivudine and adefovir. Hepatology 2005;41:1391-8

Text: Magnus Lindh, Viruslaboratoriet, Sahlgrenska Universitetssjukhuset